Manual de Técnicas básicas para diagnóstico parasitológico

  • Posted on: 30 August 2018
  • By: admin_iiet

PROTOCOLO DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO

TÉCNICA DE CONCENTRACIÓN

Materiales:

  • Frasco de toma de muestra de materia fecal
  • Gasa cuádruple
  • Embudo
  • Centrífuga
  • Tubo de centrífuga de plástico de 15 ml
  • Palillos de plástico
  • Portaobjetos
  • Cubreobjetos
  • Colorante Amido Schwartz (ver anexo para preparación de este colorante).
  • Varilla de madera o de vidrio

 

Es recomendable, emplear una técnica de concentración, preferiblemente por centrifugación o simple sedimentación, con la cual el operador se encuentre más habituado y por ende capacitado. El propósito de esta técnica es identificar huevos, larvas de helmintos y quistes de protozoarios (en el menor volumen la mayor cantidad de huevos y larvas presentes).

A modo de ejemplo se describe la técnica más simple de este grupo.

      a)En el mismo frasco de toma de muestra, mezclar cantidades iguales de materia fecal fresca y agua del grifo, homogeneizarla hasta obtener una consistencia líquida.

       Nota: en caso de recibir heces con conservante, las larvas se encontrarán muertas, dificultando su identificación y clasificación. Además el uso de conservante impide la                  utilización de la muestra para técnicas como Baermann o Harada Mori.

      b) Filtrar aproximadamente 5 ml del líquido a través de gasa cuádruple colocada en un embudo, depositando el líquido en un tubo de centrífuga de 15 ml plástico resistente           al calor, para su posterior reutilización.

      c) Centrifugar a 3.000 r.p.m durante 5 minutos, descartar el líquido sobrenadante. Agitar violentamente el sedimento que quedó depositado en el fondo del tubo hasta                     homogeneizarlo con el líquido excedente.

      d)Colocar con palillos de plásticos sobre un porta-objeto una gota del sedimento y una gota de tinción Amido Schwartz (Tinción de Taranto).

 

Nota: para preparar la tinción pesar 30microgramos de colorante negro de Amido + 10ml de agua destilada, mezclar con varilla y calentar a baño maría para disolver los cristales y evitar la precipitación (evitar hervor) por 2 a 5 minutos. El preparado debe ser sometido a nuevos baño maría si se observan cristales (aprox. cada 2 a 3 semanas). Si se ve tono rojizo al microscopio es indicador de precipitación).

Mezclar colorante y muestra con varilla de madera vidrio o plástico y cubrir con cubre-objeto.

     e)Observar al microscopio a 10x y 40x para identificar larvas, huevos y quistes de protozoarios.Recorrer el preparado completo en guarda griega.

    Galeria de fotos de la Técnica de Concentrado

TÉCNICA DE BAERMANN MODIFICADA CON CULTIVO DE HECES:

Materiales

  • Carbón animal  o vegetal (granulado o en polvo)
  • Placa de Petri
  • Hojas de papel Tissue  (Kimwipes Kkimtech; Kimberley-Clark)
  • Colador de té con malla de alambre
  • Manguera de silicona
  • Tubo de 50ml.
  • Pipeta de Pasteur
  • Centrífuga
  • Embudos
  • Clamps
  • Soporte para embudos
  • Pinzas para clampear

 

    a) Colocar entre 5 a 10 grs de muestra luego de realizar las otras técnicas,

    b) Mezclar materia fecal fresca con carbón hasta obtener una mezcla de consistencia similar al barro (suficientemente húmeda y sólida como para adherirse al palillo         mezclador).

   c) Esta mezcla colocarla en una placa de Petri con un fondo de papel tisue húmedo, y luego cubrirla con otra piesa de papel tisue, tapar la placa e incubarla toda la noche en estufa a 28°C.

   d)Preparar el aparato de Baerman, que consite en un embudo con una manguera flexible, de modo que al momento de usarla, se pueda clampear del otro extremo. Colocar agua caliente (35 a 40ºC) en el sistema de Berman  en el embudo con la manguera clampeada.

   e)Colocar  un colador sobre el embudo y sobre el mismo colocar la mezcla hasta que quede en contacto con el agua, sin cubrir la materia fecal para  no alterarla.

 Nota: Cuanto más caliente el agua, más móviles son las larvas (37 a 40ºC es lo más caliente que toleran).  Algunas larvas de nematodes son termotáxicas y se mueven hacia el agua caliente en el embudo (la superficie se enfría más rápido que el medio del embudo).

Nota: En vista que se buscan larvas vivas, cualquier cosa que se haga con la materia fecal que pueda matar las larvas debería ser evitado (no deje que se seque, no lo ponga en formol, no la congele, y hasta dejarlo en la heladera durante una noche podría comprometer la motilidad de las larvas).

Cuando la larva se coloca en agua, comenzaran a moverse de manera randómica y a ciertos intervalos de tiempo algunos de ellos van a migrar a través del papel y caerán en el agua. Dado que no pueden nadar, se hunden hacia el fondo y se acumulan allí.

Dejar reposar por una hora.Cuanto más espere, más larvas van a caer al fondo, pero con el tiempo, la materia fecal comienza a desintegrarse y pasar a través del papel, acumulándose junto a las larvas

Abrir el clampeo de la manguera.

Escurrir el líquido en un tubo de 50ml.

Centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos

Descartar el sobrenadante.

Usando una pipeta de Pasteur, tome una gota del sedimento en el fondo del tubo y colóquela para examinar bajo el microscopio a 4x y en caso de observar larvas, las mismas se identifican taxonómicamente a 40x (tenga cuidado de no re-suspender el sedimento antes de tomar la muestra).

Galeria de fotos de la Técnica de Baermann modificada con cultivo de heces.

 

RECUENTO DE HUEVOS DE HELMINTOS

      Tanto en investigaciones sobre poblaciones infectadas como de casos individuales, es importante evaluar la carga parasitaria mediante el recuento de huevos de helmintos eliminados en las heces. Si bien la concentración de huevos puede tener variaciones importantes el  recuento de huevos por gramo de heces, permite una estimación del  número de gusanos adultos en el intestino, dato importante ya sea para evaluar la relación entre la carga parasitaria y los síntomas, la acción de los medicamentos antiparasitarios y para evaluar indirectamente la polución fecal de los suelos.

TÉCNICA DE MC MASTER

Materiales

  • Cámara de Mc Master (Se consiguen en proveedores de veterinarias)
  •  
  • Pipeta gotero de plástico descartable
  • Solución saturada de NaCl (sal común) 500 grs. en 1 litro de agua de grifo
  • Balanza granataria en caso de contar con ella (para pesar la materia fecal)
  • Probeta de 1000 ml
  • Densímetro
  • Compoteras

 

Colocar la solución sobresaturada (30ml) en  la compotera.

a)Colocar 2 gramos de materia fecal sobre el colador en contacto con la solución saturada de cloruro de sodio.

b)Disgregar la materia fecal con una espátula de modo que atraviese la malla del colador.

c)Mezclar no menos de diez veces entre dos compoteras.

d)Tomar inmediatamente con pipeta Pasteur la solución y colocar en las 2 celdillas centrales de la placa hasta completar su capacidad evitando la formación de burbujas de aire.Colocar sobre la platina del microscopio y 2 a 3 minutos después comenzar el conteo utilizando 10 x.

e)Se hace foco sobre las rayas marcadas en el cubre de la placa de manera de observar todo en un mismo plano que corresponde al de flotación.

Galeria de fotos de la Técnica de Mc MASTER

Nota:Los huevos de nNematodes quedan adheridos a la superficie inferior del cubreobjeto de la cámara.Para calcular la cantidad de huevos de nematodes por gramo de heces (hpg) se procede de la siguiente manera:. Si se utilizaron ambos compartimentos de la cámara (es lo recomendable) el factor de multiplicación es de 50 y si se utilizó sólo un compartimento es de 100.

 

Recomendaciones

Como el espesor del cubre objetos de la cámara no permite el empleo de objetivos con aumentos mayores a 10X, es aconsejable previamente examinar las heces por técnicas convencionales a fin de establecer las existencia de huevos de las especies presentes. Este método, largamente probado en parasitología veterinaria, presenta como ventaja la simplicidad de la técnica, el ínfimo costo, incluso de la propia cámara (lo que permite tener un número importante de las mismas) y la practicidad de su empleo cuando se cuenta con numerosas muestras.

TÉCNICA DE HARADA-MORI.

Materiales

  • Tubos de vidrio con punta redondeada de 20cm de largo y 2,5cm de diámetro
  •  Papel de filtro de laboratorio

 

  a)Tomar un  1 gr de materia fecal fresca (sin conservante)  y  untar en el tercio inferior de una tira de papel de filtro plegada en 2 a 4 (en acordeón).

  b) Introducir el papel en el tubo de ensayo conteniendo 5 ml de agua a temperatura ambiente; de manera que la punta inferior del papel esté en contacto con el agua, pero la superficie con material fecal no.

  c)Tapar el tubo con papel de parafina (parafilm o similar). Perforar el parafilm con aguja de tipo IM para permitir aereación.

  d)Incubar en posición vertical a 28ºC por 7 días.

Nota: las larvas de Strongyloides se encontraran a partir del 2do día y las de uncinarias demorarán 7 días, al cabo de los cuales ambas están en estadío filariforme que permite su identificación taxonómica.

  e)Destapar los tubos, descartar el papel de filtro y colocar el líquido en un tubo de centrífuga.Centrifugar a 3000 rpm x 5 minutos.Descartar el sobrenadante.

  f)Usando una pipeta de Pasteur, tome una gota del sedimento en el fondo del tubo y colóquela para examinar bajo el microscopio a 410x y en caso de observar larvas, agregar una gota de lugol para inmovilizarlas, las mismas se identifican taxonómicamente a 10 ó 40x (tenga cuidado de no re-suspender el sedimento antes de tomar la muestra).

Galeria de fotos de la Técnica HARADA-MORI

TÉCNICA DE PLACA DE AGAR.

Materiales:

  • Placa de ágar de 10 cm de diámetro.
  • Agar nutritivo (Brittania, DIFCO o similar).

Preparar placa de agar en la concentración que indica el fabricante (31g por litro en el caso Brittania).

Pesar polvo y colocar en Erlenmeyer.

Agregar la cantidad correspondiente de agua de la canilla (destilada) y mezclar con varilla de vidrio.

Autoclavar por 20 minutos a 1,5 atmósferas.

Distribuir en placa de Petri a un espesor de 0,5cm.

Dejar solidificar a temperatura ambiente.

Conservar en heladera hasta el momento de uso.

Método de cultivo:

    a)Tomar 1 gr de material fecal fresca (sin uso de conservante) y colocar sobre el centro de la placa.Tapar la placa.Incubar a 37ºC por 48hs.

       (Nota: se realiza una primera lectura a las 24 hs), poner un vaso de agua en la estufa

    b)Observar en lupa estereoscópica o microscopio 4x para identificar larvas migrantes y huellas serpinginosas.

En caso de observar larvas:

Retirar la porción del agar que contiene el material fecal.

Lavar con 3 o 4 ml de agua de la canilla (destilada) a temperatura ambiente y recoger con pipeta Pasteur en un tubo de centrífuga.

Centrifugar a 3000 rpm x 5 minutos

Descartar el sobrenadante.

Usando una pipeta de Pasteur, tome una gota del sedimento en el fondo del tubo y colóquela para examinar bajo el microscopio a 10x y en caso de observar larvas, las mismas se identifican taxonómicamente a 40x (tenga cuidado de no re-suspender el sedimento antes de tomar la muestra). También se puede observar directamente utilizando el microscopio invertido para ver la presencia o ausencia de larvas, luego recién colocar entre porta y cubre para hacer la diferenciación taxonómica.

Galeria de fotos de la Técnica de Placa de Agar.

 

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